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                    國家衛健委印發 新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南(第五版)

                    2020-03-13 15:37:51點擊:

                    國家衛健委印發 新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南(第五版)

                    為指導各級疾控部門和其他相關機構開展新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測工
                    作,特制定本技術指南。
                    一、標本采集
                    (一)采集對象。
                    新型冠狀病毒肺炎疑似病例和聚集性病例,需要進行新型冠狀病毒感染診斷
                    或鑒別診斷者,或其他需要進一步篩查檢測的環境或生物材料。
                    (二)標本采集要求。
                    1.從事新型冠狀病毒檢測標本采集的技術人員應經過生物安全培訓(培訓合格)
                    和具備相應的實驗技能。采樣人員個人防護裝備(Personal Protective Equipment,
                    PPE)要求:N95 及以上防護口罩、護目鏡、連體防護服、雙層乳膠手套、防水
                    靴套;如果接觸了患者血液、體液、分泌物或排泄物,應及時更換外層乳膠手套。
                    2.住院病例的標本由所在醫院的醫護人員采集。
                    3.密切接觸者標本由當地指定的疾控機構、醫療機構負責采集。
                    4.根據實驗室檢測工作的需要,可結合病程多次采樣。
                    (三)采集標本種類。
                    每個病例必須采集急性期呼吸道標本(包括上呼吸道標本或下呼吸道標本),
                    重癥病例優先采集下呼吸道標本;根據臨床需要可留取便標本、全血標本、血清
                    標本。
                    標本種類:
                    1.上呼吸道標本:包括鼻咽拭子、咽拭子等。2.下呼吸道標本:深咳痰液、肺泡灌洗液、支氣管灌洗液、呼吸道吸取物等。
                    3.便標本:留取糞便標本約 10 克(花生大。,如果不便于留取便標本,可采
                    集肛拭子。
                    4.血液標本:盡量釆集發病后 7 天內的急性期抗凝血,采集量 5ml,建議使用含
                    有 EDTA 抗凝劑的真空釆血管采集血液。
                    5.血清標本:盡量釆集急性期、恢復期雙份血清。第一份血清應盡早(最好在
                    發病后 7 天內)釆集,第二份血清應在發病后第 3~4 周釆集。采集量 5ml,建議
                    使用無抗凝劑的真空釆血管。血清標本主要用于抗體的測定,不進行核酸檢測。
                    (四)標本采集和處理。
                    1.鼻咽拭子:采樣人員一手輕扶被采集人員的頭部,一手執拭子,拭子貼鼻孔
                    進入,沿下鼻道的底部向后緩緩深入,由于鼻道呈弧形,不可用力過猛,以免發
                    生外傷出血。待拭子頂端到達鼻咽腔后壁時,輕輕旋轉一周(如遇反射性咳嗽,
                    應停留片刻),然后緩緩取出拭子,將拭子頭浸入含 2~3ml 病毒保存液(也可使
                    用等滲鹽溶液、組織培養液或磷酸鹽緩沖液)的管中,尾部棄去,旋緊管蓋。
                    2.咽拭子:被采集人員先用生理鹽水漱口,采樣人員將拭子放入無菌生理鹽水
                    中濕潤(禁止將拭子放入病毒保存液中,避免抗生素引起過敏),被采集人員頭部
                    微仰,嘴張大,并發“啊”音,露出兩側咽扁桃體,將拭子越過舌根,在被采集者
                    兩側咽扁桃體稍微用力來回擦拭至少 3 次,然后再在咽后壁上下擦拭至少 3 次,
                    將拭子頭浸入含 2~3ml 病毒保存液(也可使用等滲鹽溶液、組織培養液或磷酸
                    鹽緩沖液)的管中,尾部棄去,旋緊管蓋。咽拭子也可與鼻咽拭子放置于同一管
                    中。
                    3.鼻咽抽取物或呼吸道抽取物:用與負壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部插入鼻腔或氣管,接通負壓,旋轉收集
                    器頭部并緩慢退出,收集抽取的粘液,并用 3ml 采樣液沖洗收集器 1 次(亦可用
                    小兒導尿管接在 50ml 注射器上來替代收集器)。
                    4.深咳痰液:要求病人深咳后,將咳出的痰液收集于含 3ml 采樣液的 50ml 螺口
                    塑料管中。如果痰液未收集于采樣液中,可在檢測前,加入 2~3ml 采樣液,或
                    加入痰液等體積的痰消化液。
                    痰消化液儲存液配方:
                    成分 每瓶
                    二硫蘇糖醇 0.1g
                    氯化鈉 0.78g
                    氯化磷 0.02g
                    磷酸氫二鈉 0.112g
                    磷酸二氫鉀 0.02g
                    水 7.5ml
                    pH7.4±0.2 (25℃)
                    臨用前將儲存液以去離子水稀釋至 100 ml。
                    也可以采用痰液等體積的含 1g/L 蛋白酶 K 的磷酸鹽緩沖液將痰液化。
                    5.支氣管灌洗液:將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插入氣管(約 30cm 深處),
                    注入 5ml 生理鹽水,接通負壓,旋轉收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液,
                    并用采樣液沖洗收集器 1 次(亦可用小兒導尿管接在 50ml 注射器上來替代收集)。
                    6.肺泡灌洗液:局部麻醉后將纖維支氣管鏡通過口或鼻經過咽部插入右肺中葉
                    或左肺舌段的支管,將其頂端契入支氣管分支開口,經氣管活檢孔緩緩加入滅菌生理鹽水,每次 30~50ml,總量 100~250ml,不應超過 300ml。
                    7.糞便標本:取 1ml 標本處理液,挑取黃豆粒大小的便標本加至管中,輕輕吹
                    吸 3-5 次,室溫靜置 10 分鐘,以 8000 rpm 離心 5 分鐘,吸取上清液進行檢測。
                    糞便標本處理液可自行配制:1.211 g Tris,8.5 g 氯化鈉,1.1 g 無水氯化鈣或 1.47
                    g 含結晶水的氯化鈣,溶解至 800 ml 去離子水中,用濃鹽酸調節 pH 為 7.5,以去
                    離子水補充至 1000 ml。也可使用 HANK’S 液或其它等滲鹽溶液、組織培養液或
                    磷酸鹽緩沖液溶解便標本制備便懸液。如患者出現腹瀉癥狀,則留取糞便標本 3~
                    5ml,輕輕吹打混勻后,以 8000 rpm 離心 5 分鐘,吸取上清液備用。
                    7. 肛拭子:用消毒棉拭子輕輕插入肛門 3~5cm,再輕輕旋轉拔出,立即放入含
                    有 3~5ml 病毒保存液的 15ml 外螺旋蓋采樣管中,棄去尾部,旋緊管蓋。
                    8.血液標本:建議使用含有 EDTA 抗凝劑的真空釆血管采集血液標本 5ml,根
                    據所選用核酸提取試劑的類型確定以全血或血漿進行核酸提取。如需分離血漿,
                    將全血 1500~2000rpm 離心 10 分鐘,收集上清于無菌螺口塑料管中。
                    9.血清標本:用真空負壓采血管采集血液標本 5ml,室溫靜置 30 分鐘,1500~
                    2000rpm 離心 10 分鐘,收集血清于無菌螺口塑料管中。
                    其他材料:依據設計需求規范采集。
                    (五)標本包裝。
                    標本采集后在生物安全二級實驗室生物安全柜內分裝。
                    1.所有標本應放在大小適合的帶螺旋蓋內有墊圈、耐冷凍的樣本采集管里,擰
                    緊。容器外注明樣本編號、種類、姓名及采樣日期。
                    2.將密閉后的標本裝入密封袋,每袋限一份標本。樣本包裝要求要符合《危險
                    品航空安全運輸技術細則》相應的標準。3. 涉及外部標本運輸的,應根據標本類型,按照 A 類或 B 類感染性物質進行三
                    層包裝。
                    (六)標本保存。
                    用于病毒分離和核酸檢測的標本應盡快進行檢測,能在 24 小時內檢測的標
                    本可置于 4℃保存;24 小時內無法檢測的標本則應置于-70℃或以下保存(如無
                    -70℃保存條件,則于-20℃冰箱暫存)。血清可在 4℃存放 3 天,-20℃以下可長
                    期保存。應設立專庫或專柜單獨保存標本。標本運送期間應避免反復凍融。
                    (七)標本送檢。
                    標本采集后應盡快送往實驗室,如果需要長途運輸,建議采用干冰等制冷方
                    式進行保藏。
                    1.上送標本
                    各。ㄗ灾螀^、直轄市)聚集性病例的標本,上送中國疾病預防控制中心病
                    毒病預防控制所進行檢測復核,并附樣本送檢單(見附表)。
                    2.病原體及標本運輸
                    2.1 國內運輸
                    新型冠狀病毒毒株或其他潛在感染性生物材料的運輸包裝分類屬于 A 類,對
                    應的聯合國編號為 UN2814,包裝符合國際民航組織文件 Doc9284《危險品航空
                    安全運輸技術細則》的 PI602 分類包裝要求;環境樣本屬于 B 類,對應的聯合國
                    編號為 UN3373,包裝符合國際民航組織文件 Doc9284《危險品航空安全運輸技
                    術細則》的 PI650 分類包裝要求;通過其他交通工具運輸的可參照以上標準包裝。
                    新型冠狀病毒毒株或其它潛在感染性材料運輸應按照《可感染人類的高致病
                    性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規定》(原衛生部令第 45 號)辦理《準運證書》。
                    2.2 國際運輸
                    新型冠狀病毒毒株或樣本在國際間運輸的,應規范包裝,按照《出入境特殊
                    物品衛生檢疫管理規定》辦理相關手續,并滿足相關國家和國際相關要求。
                    2.3 毒株和樣本管理
                    新型冠狀病毒毒株及其樣本應由專人管理,準確記錄毒株和樣本的來源、種
                    類、數量,編號登記,采取有效措施確保毒株和樣本的安全,嚴防發生誤用、惡
                    意使用、被盜、被搶、丟失、泄露等事件。
                    二、新型冠狀病毒的實驗室檢測
                    新型冠狀病毒感染的常規檢測方法為實時熒光 RT-PCR。任何新型冠狀病毒
                    的檢測都必須在具備條件的實驗室由經過相關技術安全培訓的人員進行操作。本
                    指南中的核酸檢測方法主要針對新型冠狀病毒基因組中開放讀碼框 1ab(open
                    reading frame 1ab,ORF1ab)和核殼蛋白(nucleocapsid protein,N)。
                    實驗室確認陽性病例需滿足以下兩個條件中的一個:
                    1. 同一份標本中新型冠狀病毒 2 個靶標(ORF1ab、N)實時熒光 RT-PCR 檢測結
                    果均為陽性。如果出現單個靶標陽性的檢測結果,則需要重新采樣,重新檢測。
                    如果仍然為單靶標陽性,判定為陽性。
                    2. 兩種標本實時熒光 RT-PCR 同時出現單靶標陽性,或同種類型標本兩次采樣檢
                    測中均出現單個靶標陽性的檢測結果,可判定為陽性。
                    核酸檢測結果陰性不能排除新型冠狀病毒感染,需要排除可能產生假陰性的
                    因素,包括:樣本質量差,比如口咽等部位的呼吸道樣本;樣本收集的過早或過
                    晚;沒有正確的保存、運輸和處理樣本;技術本身存在的原因,如病毒變異、PCR抑制等。
                    三、實時熒光 RT-PCR 方法檢測新型冠狀病毒核酸
                    (一)目的。
                    規范實時熒光 RT-PCR 方法檢測新型冠狀病毒核酸的工作程序,保證實驗結
                    果的正確可靠。
                    (二)范圍。
                    適用于實時熒光 RT-PCR 方法檢測新型冠狀病毒核酸。
                    (三)職責。
                    檢測人員:負責按照本檢測細則對被檢樣本進行檢測。
                    復核人員:負責對檢測操作是否規范以及檢測結果是否準
                    確進行復核。
                    部門負責人:負責對科室綜合管理和檢測報告的審核。
                    (四)樣本接收和準備。
                    核對被檢樣本姓名、性別、年齡、編號及檢測項目等;待檢樣本的狀態如有
                    異常,需注明;待檢樣本應存放于-70℃冰箱保存。
                    (五)檢測項目。
                    1.新型冠狀病毒核酸測定(實時熒光 RT-PCR 方法)推薦選用針對新型冠狀病毒
                    的 ORF1ab、N 基因區域的引物和探針。
                    靶標一(ORF1ab):
                    正向引物(F):CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
                    反向引物(R):ACGATTGTGCATCAGCTGA
                    熒光探針(P):5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
                    靶標二(N):
                    正向引物(F):GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
                    反向引物(R):CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
                    熒光探針(P):5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'
                    核酸提取和實時熒光 RT-PCR 反應體系及反應條件參考相關廠家試劑盒說明。
                    2.結果判斷
                    陰性:無 Ct 值或 Ct≥40。
                    陽性:Ct 值<37,可報告為陽性。
                    灰度區:Ct 值在 37-40 之間,建議重復實驗,若重做結果 Ct 值<40,擴增曲線有
                    明顯起峰,該樣本判斷為陽性,否則為陰性。
                    注:如果用的是商品化試劑盒,則以廠家提供的說明書為準。
                    四、病原生物安全實驗活動要求
                    根據目前掌握的新型冠狀病毒的生物學特點、流行病學特征、臨床資料等信
                    息,該病原體暫按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進行管理,具
                    體要求如下:
                    (一)病毒培養。
                    病毒培養是指病毒的分離、培養、滴定、中和試驗、活病毒及其蛋白純化、
                    病毒凍干以及產生活病毒的重組實驗等操作。
                    上述操作應當在生物安全三級實驗室的生物安全柜內進行。使用病毒培養物
                    提取核酸,裂解劑或滅活劑的加入必須在與病毒培養等同級別的實驗室和防護條
                    件下進行,裂解劑或滅活劑加入后可比照未經培養的感染性材料的防護等級進行操作。實驗室開展相關活動前,應當報經國家衛生健康委批準,取得開展相應活
                    動的資質。
                    (二)動物感染實驗。
                    動物感染實驗是指以活病毒感染動物、感染動物取樣、感染性樣本處理和檢
                    測、感染動物特殊檢查、感染動物排泄物處理等實驗操作,應當在生物安全三級
                    實驗室的生物安全柜內操作。實驗室開展相關活動前,應當報經國家衛生健康委
                    批準,取得開展相應活動的資質。
                    (三)未經培養的感染性材料的操作。
                    未經培養的感染性材料的操作是指未經培養的感染性材料在采用可靠的方
                    法滅活前進行的病毒抗原檢測、血清學檢測、核酸提取、生化分析,以及臨床樣
                    本的滅活等操作,應當在生物安全二級實驗室進行,同時采用生物安全三級實驗
                    室的個人防護。
                    (四)滅活材料的操作。
                    感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進行的核酸檢測、抗原檢測、
                    血清學檢測、生化分析等操作應當在生物安全二級實驗室進行。分子克隆等不含
                    致病性活病毒的其他操作,可以在生物安全一級實驗室進行。
                    附表
                    新型冠狀病毒檢測標本送檢表
                    送樣單位(蓋章): 送樣日期: 年 月 日
                    送樣人:
                    標本 編號
                    標本類型 姓名 性別 年齡 發病日期 就診日期 采樣日期樣本來源是否為聚集性病例
                    §檢測日期
                    實時熒光 RT-PCR 基因序列同源性*
                    備注
                    試劑廠家 靶基因 一代 深度測序基因序列同源性*非必選項,注明完成具體靶基
                    因序列/全基因組序列,及其與新型冠狀病毒的同源性。樣本來源是否為聚集性病

                    例§填是或否。


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